Serial Block-face SEM
それは何でしょうか? なぜ使用するのでしょうか? 基礎知識
歯細管の3D画像
シリアルブロックフェイスSEMとは？
シリアルブロックフェース走査電子顕微鏡 (SBF-SEM) は、生物標本の高解像度で大容量の 3 次元再構成画像を作成できるため、急速に注目を集めている体積電子顕微鏡技術です。SBF-SEM は、比較的厚い標本の連続層での自動画像化を容易にします。その結果、一連の画像が生まれ、それらを組み合わせて標本の体積表現を作成し、その微細構造に関する比類のない洞察を提供します。
通常は樹脂に埋め込まれた標本は、SEM チャンバー内に統合されたウルトラミクロトームに配置されます。ウルトラミクロトームのダイヤモンド ナイフは、ブロックの表面から極薄層を取り除きます。各セクションの後に、新たに露出されたブロック面は、走査型電子ビームを使用して画像化されます。この反復プロセスは、標本の必要な体積がキャプチャされるまで継続されます。取得した画像は、デジタル的に積み重ねられ、位置合わせされて、3 次元モデルを形成します。
SBF-SEMの歴史
この技術のアイデアは、1980 年代に Steve Leighton氏 と Alan Kuzirian氏 という二人の研究者によって提案されました。彼らは、SEMの真空チャンバー内にブロックフェースイメージングユニットを組み込む装置を開発し、「三次元顕微鏡法」という特許を取得しました。
2000 年代に入ると、Winfried Denk氏 と Heinz Horstmann氏 という二人の研究者 が、神経組織の研究のために SBF-SEM の最初の実用モデルを作りました。
彼らは、ブロックフェースイメージングユニットと SEM を一体化させることで、試料の切断面を自動的に連続撮影し、詳細な三次元構造を再現することができるシステムを発表しました。
SBF-SEM システムには何が含まれていますか?
ダイヤモンドナイフ: ダイヤモンド ナイフは、SBF-SEM システム内に組み込まれたブロックフェースイメージングユニットの非常に重要な部品です。このナイフは、数十ナノメートルの厚さにスライスできるほど、刃先が 1 ～ 2 nm の曲率半径で鋭利になっています。そのため、切断面は変形や損傷がほとんどなく、滑らかです。ダイヤモンドの表面は、デブリの生成を防ぐために特殊な方法で処理されています。
精密 Z ステージ: 精密 Z ステージとは、試料ブロックを固定しダイヤモンド ナイフで切断する際に、サンプルを正確に位置決めするため重要なプラットフォームです。ステージは、切断中にかかる下向きの力に耐えるために、高い剛性を持っています。また、ステージの動きはフィードバック ループで制御されており、一定のステップ幅とドリフトの補正が可能です。
後方散乱電子検出器: 後方散乱電子検出器 (BSED) は、通常、ポールピースの下に配置されるか、インレンズ構成のカラム内に位置され、サンプルから反射・散乱された電子が検出されるよう設計されています。SBF-SEM イメージングでは、ダイヤモンド ナイフの滑らかなカット面の特徴から、二次電子から取得される画像には通常、非常に限られた情報しかありませんでした。ただし、重金属染色がさまざまな細胞成分に選択的に結合するなどより高いコントラストが得られる特徴があり、BSEDにはさまざまな生物学的構造間の組成コントラストを生み出すことが可能です。SBF-SEM で使用される高感度 BSED 検出器は、収集効率を向上させるために非常に薄いパッシベーション層を備えていることが多く、その結果、検出器ダイオードの寿命が短くなる可能性があります。
SBF-SEM 用のサンプルを準備するにはどうすればよいですか?
SBF-SEM 用のサンプルの準備には、標本が可能な限り未変性の状態を維持し、電子ビームで画像化する際にコントラストを生成するのに適した状態を保つために、いくつかの重要なステップが含まれます。最初のステップは、サンプルの構造を安定させる固定です。灌流固定は、迅速かつ全体的に行われるため、SBF-SEM サンプルによく使用されます。これは、カコジル酸、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどの溶液の組み合わせを使用して行われます。その後、電子顕微鏡下でのコントラストを高めるために、重金属で染色します。サンプルは、四酸化オスミウムまたはフェロシアン化オスミウム、酢酸ウラニル、アスパラギン酸鉛、チオカルボヒドラジドなどの重金属塩溶液に浸されます。染色手順は、細胞または細胞外成分のコントラストを高めるために、複数回実行されることがよくあります。最後のステップでは、通常、エタノールまたはアセトンを使用してサンプルを脱水し、熱または UV で硬化する樹脂に埋め込みます。樹脂の選択は、蛍光の保存やイメージング条件下での安定性などの要因によって異なります。
要約すると、vEM のサンプル準備は、サンプルとイメージング モダリティの特定の要件に合わせて調整された細心の注意を払ったプロセスであり、イメージング環境との互換性を確保しながら生物学的整合性を維持することを目的としています。
1. Leighton, S. B. (1981). SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM — A technical note. Scanning, 4(1), 85-89.
2. Leighton, S. B., & Kuzirian, A. M. (1981). U.S. Patent No. 4,253,837. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.
3. Denk, W., & Horstmann, H. (2004). Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology, 2(11), e329.